Padronização e Comparação de Métodos Aplicados à Extração de RNA Total em Serpentes do Gênero Micrurus

Jéssica Cáceres Martins, Nelson Jorge da Silva Junior, Paula Carolina Rodrigues de Almeida, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa, Vera Aparecida Saddi

Resumo


Áreas de genoma e transcriptoma permitem a análise do perfil genético das toxinas produzidas por serpentes do gênero Micrurus, a partir da extração de RNA total das glândulas de veneno. A obtenção de RNA com boa qualidade é uma etapa fundamental para gerar dados de alto valor científico. Neste estudo, adaptações foram realizadas no processo de extração pelo método de Trizol, resultando em dois protocolos modificados que evidenciam a importância de cada etapa para a obtenção do material genético. O objetivo foi padronizar a metodologia utilizada para a extração de RNA total em glândulas de veneno de serpentes. O RNA total foi extraído de glândulas de veneno colhidas a fresco de espécimes de Micrurus surinamensis, acondicionadas em RNAlater® e purificados pela metodologia de Trizol. No protocolo 1 foi utilizado o homogeneizador, com a manutenção das amostras em gelo, e o protocolo 2 as especificações do método original proposto foram mantidas, excluindo apenas a etapa de homogeneização. O material obtido foi submetido à análise por espectrofotometria e eletroforese. Os dados foram analisados por estatística descritiva e comparativa, utilizando o teste T. Contrapondo a mesma quantidade de tecido, as amostras submetidas à extração pelo protocolo 1 apresentaram uma quantidade média de RNA superior àquela obtida pelo protocolo 2, com médias de 1560 ng (+366ng) e 132 ng (+31,5ng) de RNA (p=0,0005). Apesar das modificações nos protocolos, a integridade do produto extraído nos dois grupos foi equivalente, com valores de 1,94 (+0,022ng) e 1,96 (+0,013ng) (p=0,55). Conclui-se que o protocolo 1, que utiliza a homogeneização, deve permitir maior contato do Trizol com o tecido, garantindo melhor desnaturação das proteínas teciduais, enquanto as baixas temperaturas devem interromper a atividade enzimática das RNases, permitindo a obtenção de maiores concentrações de RNA e conservando a qualidade do material extraído.

Standardization and Comparison of Methods Applied to Total RNA Extraction in Snakes of the Genus Micrurus

Genome and transcriptome allow the analysis of the genetic profile of the toxins produced by snakes of the genus Micrurus, from the extraction of total RNA of the venom glands. To obtain RNA with good quality is a fundamental step to generate data of high scientific value. In this study, adaptations were made in the RNA extraction process by the Trizol method, with two modified protocols that highlight the importance of each step to obtain the genetic material. The objective of this study was to standardize the methodology used for the extraction of total RNA in the venom glands of coralsnakes. Total RNA was extracted from venom glands from specimens of Micrurus surinamensis, conditioned on RNAlater®, and purified by the Trizol methodology. In protocol 1 the homogenizer was used with the maintenance of the samples on ice, and protocol 2 the specifications of the original method proposed were maintained, excluding only the homogenization step. The material obtained was analyzed by spectrophotometry and electrophoresis. The data were analyzed by descriptive and comparative statistics, using the T-test. Comparing the same amount of tissue, the samples submitted to the extraction by protocol 1 presented an average amount of RNA superior to that obtained by protocol 2, with averages of 1560 ng (+ 366ng) and 132 ng (+ 31.5ng) RNA (p = 0.0005). Despite the modifications in the protocols, the integrity of the product extracted in the two groups was equivalent, with values of 1.94 (+ 0.022ng) and 1.96 (+ 0.013ng) (p = 0.55). It is concluded that protocol 1, which uses homogenization, should allow a greater contact of Trizol with the tissue, guaranteeing better denaturation of the tissue proteins, while the low temperatures should interrupt the enzymatic activity of the RNases, allowing to obtain higher concentrations of RNA and preserving the quality of the extracted material.

Palavras-chave


Extração de RNA total; Micrurus; Glândula de veneno; Trizol

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DOI: http://dx.doi.org/10.18224/evs.v45i1.5724

 

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evs | Pontifícia Universidade Católica de Goiás | e-ISSN 1983-781X | Qualis B3

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